KROMATOGRAFI GAS
A. PENDAHULUAN
Pengertian dari kromatografi suatu metode yang dinamis untuk pemisahan dan deteksi senyawa-senyawa organik yang mudah menguap dan senyawa-senyawa gas anorganik dalam suatu campuran. KG merupakan teknik analisis yang telah digunakan dalam bidang-bidang industri, lingkungan, farmasi, minyak, kimia, klinik, forensik, dan makanan. Bersifat destruktif dan non-destruktif tergantung pada detector yang digunakan. KG merupakan teknik instrumental yang dikenalkan pertama kali pada tahun 1950-an, dan saat ini merupakan alat utama yang digunakan oleh laboratorium untuk melakukan analisis. Perkembangan teknologi yang signifikan dalam bidang elektronik, computer, dan kolom telah menghasilkan batas deteksi yang lebih rendah serta identifikasi senyawa menjadi lebih akurat melalui teknik analisis dengan resolusi yang meningkat.
KG dapat diotomatisasi untuk analisis sampel padat, cair dan gas. Sampel padat dapat diekstraksi atau dilarutkan dalam suatu pelarut sehingga dapat diinjeksikan ke dalam system KG, demikian juga sampel gas dapat langsung diambil dengan penyuntik (syringer) yang ketat terhadap gas.
B. PRINSIP KROMATOGRAFI GAS
KG merupakan teknik pemisahan yang mana solut-solut yang mudah menguap (dan stabil terhaddap panas) bermigrasi melalui kolom yang mengandung fase diam dengan suatu kecepatan yang tergantung pada rasio distribusinya. Pemisahan pada KG didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solute dengan fasa diam. Selain itu juga penyebaran cuplikan diantara dua fasa. Salah satu fasa ialah fasa diam yang permukaannya nisbi luas dan fasa yang lain yaitu gas yang mengelusi fasa diam. Fasa gerak yang berupa gas akan mengelusi solute dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke detector. Prinsip utama pemisahan dalam kromatografi gas adalah berdasarkan perbedaan laju migrasi masing-masing komponen dalam melalui kolom. Komponen-komponen yang terelusi dikenali (analisa kualitatif) dari nilai waktu retensinya (Tr).
C. SISTEM PERALATAN
Pada dasarnya peralatan kromatografi gas terdiri dari:
1. Tabung gas pembawa (sebagai fasa gerak)
2. Alat pengaturan tekanan
3. Alat pengukur kecepatan aliran gas
4. Kolom kromatografi
5. Injektor (tempat injeksi sampel)
6. Termostat oven
7. Meter gelembung sabun
8. Detektor
9. Penerus sinyal
10. Read out – kromatogram
1. Fase pada Kromatografi Gas
· Fasa Gerak Dan Fasa Diam Kromatografi Gas
a. Fasa Gerak Kromatografi Gas
Ø Fasa gerak dalam kromatografi gas biasanya disebut juga gas pembawa karena tujuan utamanya adalah membawa solute ke dalam kolom, karenanya gas pembawa tidak mempengaruhi selektifitas.
Syarat-syarat gas pembawa adalah :
· Tidak reaktif
· Murni atau kering
· Dapat disimpan dalam tangki bertekanan tinggi (merah untuk hydrogen, abu-abu untuk nitrogen)
Ø Gas pembawa biasanya mengandung gas helium, nitrogen, hydrogen, atau campuran argon dan metana.Pemilihan gas pembawa tergantung pada penggunaan spesifik dan jenis detector yang digunakan, tipe kolom (packing atau kapiler) serta biaya.Helium merupakan contoh gas pembawa yang sering digunakan, karena memberikan efisiensi kromatografi yang lebih baik (mengurangi pelebaran pita).
Table 1. Gas pembawa dan jenis detector
| Gas pembawa | Detector |
| Hydrogen | Hantar panas |
| Helium | Hantar panas Ionisasi nyala Fotometri nyala |
| Nitrogen | Ionisasi nyala Tangkap electron Fotometri nyala |
| Argon | Ionisasi nyala |
| Argon + Metana 5% | Tangkap electron |
| Karbon dioksida | Hantar panas |
Ø Untuk setiap pemisahan dengan KG terdapat kecepatan optimum gas pembawa yang terutama bergantung pada diameter kolom. Kecepatan alir gas kira-kira 50-70 ml/menit untuk kolom dengan diameter dalam 6 mm, 25-30ml/menit untuk kolom dengan diameter dalam 3 mm dan 0,2-2 ml/menit untuk kolom kapiler.
Ø Fasa mobil atau gas pembawa dipasok dari tangki melalui pengatur pengurangan tekanan.Pada tekanan. Pada tekanan gas pembawa 10-40 psi akan memberikan laju alir 2-50 cm3/menit.
b. Fasa Diam Kromatografi Gas
Ø Padatan (kromatografi gas-padat) sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis.
Ø cairan (kromatografi gas-cair)Kromatografi gas-cair, biasanya digunakan cairan bertitik didih tinggi dan proses serapannya lebih banyak berupa partisi. Misalnya ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molecular.
2. Ruang Suntik Sampel pada KG
Fungsi dari ruang suntik ini adalah untuk mengantarkan sampel ke dalam aliran gas pembawa. Penyuntikan sampel dapat dilakukan secara manual atau secara otomatis (yang dapat menyesuaikan jumlah sampel). Pelarut sampel yang umum digunakan yaitu hidrokarbon bertitik didih rendah, etil eter, alcohol dan keton. Pelarut yang dipilih harus memiliki sifat yang berbeda secara nyata dengan sampel yang dianalisis. Sampel yang akan dikromatografi dimasukkan ke dalam ruang suntik melalui gerbang suntik berupa lubang yang ditutupi dengan septum atau pemisah karet. Ruang suntik harus dipanaskan tersendiri yaitu 10-15 0C lebih tinggi daripada suhu kolom maksimum.
Penyuntikan dalam KG dapat dilakukan dengan memakai alat suntik kedap gas atau sistem penyuntikan yang telah dirancang secara khusus.
3. Kolom pada KG
Kolom merupakan merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di dalamnya terdapat fase diam. Kolom dapat berbentuk lurus, bengkok(misal berbentuk V atau W), dan kumparan/spiral. Ada 2 jenis kolom dalam GC, yaitu:
- Kolom kemas terdiri atas fase cair yang tersebar pada permukaan penyangga yang lembam (inert). Jenis kolom ini terbuat dari gelas atau logam yang tahan karat atau dari tembaga dan aluminium. Panjang kolom yaitu 1-5 m dengan diameter 1-4 mm. ukuran partikael fase diam berkisar 60-80 mesh (250-170 µm). untk KGC dipakai lapsan tipis pada padatan pendukung dengan ketebalan 1-10 µm, dan maksimum fasa diam cair terdapat pada padatan pendukung adalah 10%.
- Kolom kapiler, jenis kolom ini berbeda dengan kolom kemas. Rongga pada bagian dalam kolom yang menyerupai pipa (tube). Oleh karena itu kolom kapiler disebut juga “Open Tubular Columns”. Fasa diam melekat mengelilingi dinding dalam kolom.
Table 2. Perbandingan Kolom Kemas dan Kolom Kapiler
| Parameter | Kolom kemas | Kolom kapiler |
| Tabung | Baja tahan karat (stainless steel) | Silika (SiO3) dengan kemurnian yang tinggi (kandungan logam < 1 ppm) |
| Panjang | 1-5 m | 5-60 m |
| Diameter dalam | 2-4 mm | 0,10-0,53 |
| Jumlah lempeng/meter | `1000 | 5000 |
| Total lempeng | 5000 | 300.000 |
| Tebal lapisan lilim | 10 mikron | 0,05-1 mikron |
| Resolusi | Rendah | Tinggi |
| Kec. Aliran (mL/menit) | 10-60 | 0,5-1,5 |
| kapasitas | 10 µg/puncak | <100 ng/puncak |
Gambar 3. Jenis kolom pada kromatografi gas
4. Detektor pada KG
Detektor merupakan perangkat yang diletakkan pada ujung kolom tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang membawa komponen hasil pemisahan. Detektor pada kromatografi merupakan sensor elektronik yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen didalamnya menjadi sinyal elektronik. Sinyal elektronik detektor untuk analisa kuantitatif maupun kualitatif terhadap komponen-komponen yang terpisah di antara fasa diam dan fasa gerak. Detektor digunakan untuk memonitor gas pembawa yang keluar dari kolom dan merespon perubahan komposisi solut yang terelusi.
Ø Syarat-syarat yang harus dimiliki oleh sebuah detektor, antara lain:
· Dapat merespon dengan cepat kehadiran solut
· Memiliki rentangan respon linier yang luas
· Memiliki kepekaan tinggi
· Stabil pada pengoperasian
Ø Beberapa parameter yang sering dijumpai pada detektor, yaitu:
a. Ratio signal
à Ratio signal terhadap detector (S/N) menyatakan hubungan antara respon detektor dengan getaran rekorder setelah pembesaran maksimum. Besaran S/N digunakan untuk menentukan Batas Deteksi Minimum.
b. Batas Deteksi Minimum (BDM)
à Harga BDM telah tercapai kesepakatan adalah sebesar 2 S/N. factor respon dinyatakan dengan rumus A/M, dimana A adalah area puncak dan M adalah cuplikan untuk detector yang peka terhadap massa. Untuk detector yang peka terhadap konsentraasi digunakan rumus AF/M, dimana F adalah laju alir pembawa gas.
c. Kisaran Dinamik Linear (KD)
à Kisaran Dinamik (KD) menyatakan rasio besarnya solut terhadap besaran solut minimum yang dapat terdeteksi secara linier. Makin besar harga KD makin besar jangkauan konsentrasi yang dapat dianalisis. Pengertian yang lebih operasional untuk KD adalah besaran konsentrasi cuplikan dimana respon berdasarkan pengukuran area kurang lebih 20%.
d. Kespesifikan/ keuniversalan detektor
Ø Jenis-Jenis Detektor
Berdasarkan Kespesifikannya
1. Detektor Spesifik
Detektor spesifik yaitu detector yang hanya dapat mendeteksi beberapa jenis senyawa saja. Contoh: DTE dan DFN
2. Detektor Universal
Detektor Universal yaitu detector yang dapat mendeteksi semua jenis senyawa. Contoh: DHP dan DIN.
Berdasarkan pengaruhnya terhadap cuplikan
1. Detektor Destruktif
Detektor Destruktif adalah jenis detector yang dapat merusak cuplikan,
contoh: DIN.
2. Detektor non destruktif
Detektor non destruktif adalah jenis detector yang tidak merusak cuplikan, contoh: DHP.
Berdasarkan cara kerjanya
1. Detektor Hantaran Panas (DHP atau Thermal Conductivity Detector =TCD)
Detektor ini didasarkan bahwa panas dihantarkan dari benda yang suhunya tinggi ke benda lain yang suhunya lebih rendah. Pada detektor ini filament harus dilindungi dari udara ketika filamen itu panas dan tidak boleh dipanaskan tanpa dialiri gas pembawa. Secara teoritis keuntungannya tidak merusak komponen yang dideteksi. Detektor hantar panas termasuk detektor konsentrasi yakni semua molekul yang melewatinya diukur jumlahnya dan tidak tergantung pada laju aliran fasa gerak.
2. Detektor Ionisasi Nyala (DIN)
Detektor ini mengukur jumlah atom karbon dan bersifat umum untuk semua senyawa organik (Senyawa Flour tinggi dan karbondisulfida tidak terdeteksi). Respon sangat peka, dan linier ditinjau dari segi ukuran cuplikan serta teliti.
Hal yang perlu diperhatikan dalam detektor ini adalah kecepatan aliran O2 dan H2 (H2 ± 30mL per menit dan O2 sepuluh kalinya), serta suhu (harus diatas 100˚C untuk mencegah kondensasi uap air yang mengakibatkan FID berkarat atau kehilangan sensitivitasnya)
3. Detektor Tangkapan Elektron (DTE)
Detektor ini dilengkapi dengan radioaktif yaitu 3H atau 63Ni. Dasar kerja detektor ini adalah penangkapan elektron oleh senyawa yang mempunyai afinitas terhadap elektron bebas, yaitu senyawa yang mempunyai unsur-unsur negatif.
4. Detektor Fotometri Nyala (DFN)
Prinsip detektor ini yaitu senyawa yang mengandung sulfur atau fosfor dibakar dalam nyala hydrogen/oksigen maka akan terbentuk spesies yang tereksitasi dan menghasilkan suatu emisi yang spesifik yang dapat diukur pada panjang gelombang tertentu. Untuk yang mengandung S diukur pada λ 393 nm, sementara yang mengandung fosfor diukur pada λ 526 nm.
5. Detektor Nitrogen Fosfor (DNF)
Detektor ini sangat selektif terhadap nitrogen dan fosfor karena adanya elemen aktif diatas aliran kapiler yang terbakar oleh plasma (1600˚C). Elemen dapat berupa logam kalium, rubidium atau sesium yang dilapiskan pada silinder kecil alumunium, dan berfungsi sebagai sumber ion di dalam plasma yang menekan ionisasi hidrokarbon di dalam plasma tetapi menaikkan ionisasi sampel yang mengandung N atau P
Table. Karakteristik beberapa detector kromatografi
| Detektor | BDM (g det-1) | KD | Batas Suhu (˚C) | Tanda-tanda Khas |
| DHP | 10-9 | 104 | 450 | Tidak merusak, peka terhadap suhu dan aliran |
| DIN | 10-12 | 107 | 400 | Merusak, sangat stabil |
| DTE | 10-13 | 102-105 | 350 | Tidak merusak, mudah terkontaminasi, peka terhadap suhu |
| DNF | 10-14 (P) 10-12 (N) | 105 105 | 400 400 | Mirip DIN Mirip DIN |
5. Komputer pada KG
Kromatografi gas modern menggunakan komputer yang dilengkapi dengan perangkat lunak (software) untuk digitalisasi signal detektor dan mempunyai beberapa fungsi, yaitu:
a. Memfasilitasi setting parameter-parameter instrument seperti: aliran fase gas; suhu oven dan pemrogaman suhu; serta pemyuntikan samel secara otomatis.
b. Menampilkan kromatogrm dan informasi-informasi lain dengan menggunakan gafik berwarna.
c. Merekam data kalibrasi, retensi, serta perhitungan-perhitungan dengan statistic.
d. Menyimpan data parameter analisis untuk analisis senyawa tertentu.
D. DERIVATISASI PADA KROMATOGRAFI GAS
Derivatisasi merupakan proses kimiawi untuk mengubah suatu senyawa menjadi senyawa lain yang mempunyai sifat-sifat yang sesuai untuk dilakukan analisis menggunakan kromatografi gas.
Macam-macam derivatisasi:
- Silylation: membuat dengan mudah sample menjadi volatile.
- Alkylation: melindungi hydrogen aktif tertentu
- Acylation: untuk senyawa yang mengandung fluorinated group
Alasan dilakukan derivatisasi adalah :
1. Senyawa tersebut memungkinkan dilakukan analisis dengan KG terkait dengan volatilitas dan stabilitasnya.
2. Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentuk kromatogram. Beberapa senyawa tidak menhasilkan bentuk kromatogram yang bagus(misal pucak kroatogram yang tumpang tindih) atau sampel yang dituju tidak terdeteksi, oleh karena itu diperlukan derivatisasi sebelum dilakukan analisis dengan kromatografi gas.
3. Meningkatkan volatilitas, misal senyawa gula. Tujuan utama derivatisasi adalah untk meningkatkan volatilitas senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap(non-volatil). Senyawa-senyawa dengan dengan berat molekul rendah biasanya tidak mudah menguap karena adanya gaya tarik menarik inter molekuler antara gugus-gugus polar, karenanya jika gugus-gugus polar ini ditutup dengan cara derivatisasi, maka akan mampu meningkatkan volatilitas senyawa tersebut secara dramatis.
4. Meningkatkan deteksi, misal untuk kolesterol dan senyawa-senyawa steroid.
5. Meningkatkan stabilitas. Beberapa senyawa volatil mengalami dekomposisi parsial karena panas sehingga diperlukan derivatisasi untuk meningkatkan stabilitasnya.
6. Meningkatkan batas deteksi pada penggunaan detektor tangkap elektron (ECD).
7. Menurunkan volatilitas suatu senyawa yang terlalu volatile.
8. Senyawa polar yang umumnya akan menyerap permukaan aktif dari column, dibuat kurang polar dengan derivatisasi.
Berikutnya akan diuraikan beberapa cara derivatisasi yang dilakukan pada kromatografi gas sebagai berikut:
a. Esterifikasi
Digunakan untuk membuat derivat gugus karboksil. Pengubahan gugus karboksil menjadi esternya akan meningkatkan volatilitas karena akan menurunkan ikatan hidrogen. Derivatisasi dengan esterifikasi dapat dilakukan dengan cara esterifikasi Fisher biasa dalam asam kuat, menurut reaksi:
H atau BF3
R-OH + R’-COOH R’-COOREster metil paling banyak digunakan, meskipun demikian ester etil, propil, dan butil juga sering dimanfaatkan untuk derivatisasi ini. Ester alifatik yang lbih panjang dibuat dengan tujuan untuk menurunkan volatilitas, meningkatkan respon detektor, meningkatkan resolusi atau daya pisah dari bahan pengganggu, dan meningkatkan resolusi dari senyawa-senyawa yang mempunyai rumus molekul yang hampir sama.
b. Asilasi
Jika sampel yang diuji mengandung fenol, alkohol, atau amin primer atau sekunder maka sering digunakan derivatisasi dengan asilasi yang merupakan reaksi yang paling umum. Derivatisasi dengan cara ini dilakukan dengan menggunakan asam asetat. Asilasi pada umumnya memberikan bentuk kromatogram yang baik.Asilasi dilakukan dengan menggunakan perfluoroanhidrida yang murni atau dalam pelarut, misalnya asetonitril dan etil asetat.
c. Alkilasi
Digunakan untuk menderivitasi alkohol, fenol, amina primer dan sekunder, imida, dan sulfhidril.Derivat dapat dibuat dengan sintesis Wiliamson, yakni alkohol atau fenol ditambah alkil atau benzil halida dengan adanya basa.
d. Sililasi
Derivat silil saat ini digunakan untuk menggantikan eter alkil untuk analisis sampel yang bersifat polar yang tidak mudah menguap.Derivat yang paling sering dibuat adalah trimetilsilil.
Derivatisasi dengan cara sililasi mempunyai beberapa keuntungan:
· Dapat dilakukan dalam vial kaca dengan tutup bersekrup yang dilapisi dengan teflon.
· Eter silil mudah dibuat untuk banyak gugus fungsi., dll.
e. Kondensasi
Reaksi kondensasi dapat digunakan untuk derivatisasi amina yang mana pereaksinya mengandung gugus karbonil.Amina primer bereaksi dengan keton membentuk enamin atau bereaksi dengan karbon disulida membentuk isotiosianat.Aseton dan siklobutanon bereaksi dengan amin primer membentuk enamin yang menghasilkan puncak tunggal dalam KG.
f. Siklisasi
Penutupan gugus polar melalui siklisasi dilakukan pada senyawa yang mengandung 2 gugus fungsi yang kira-kira sangat mudah dibuat heterosiklis beratom 5 atau 6.Beberapa heterosiklis yang terbentuk adalah ketal, boronat, triazin, dan fosfit.Asam amino juga bereaksi dengan anhidrida asam atau klorida membentuk azlakton yang bersifat lebih volatil.
